激光共聚焦實驗的樣品準備方法對比

——無需細胞爬片的樣品準備新方法 VS 傳統方法

    激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細胞內已經標記好的蛋白質和分子，為生物學研究提供了更直觀的觀測方法。如今，激光共聚焦成像已經是一個非常常規的實驗操作，應用于生物學各個研究領域中。

  在細胞實驗中，如果要進行一次激光共聚焦成像，除了要知道相關的顯微鏡參數設置和操作以外，樣品的準備也是非常重要的一環。

傳統方法

   由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求，普通的培養皿，培養板或者培養瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體。但是使用蓋玻片，在實驗操作上是非常麻煩的，如果買的是國產的蓋玻片，首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌，才能開始使用。

2.進口的細胞爬片，雖然不需要清洗，但是還是需要進行包被才能讓細胞正常貼壁生長。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細胞，熒光染色后，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上，再進行成像。如圖一所示：

圖一：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖。

操作流程：

1. 蓋玻片需用濃硫酸浸泡第二天，第二天用自來水沖洗20遍，置于無水乙醇中6小時，后用三蒸水沖洗3遍，再放在飯盒或玻璃培養皿中烘干，消毒，再烘干后放入超凈臺備用。
2. 準備好的蓋玻片或者專業的細胞爬片需要根據細胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被。
3. 培養板中放置爬片非常有技巧，要將爬片與培養板底部緊密貼合，這樣才能避免長成雙層細胞。
4. 常規免疫熒光操作后，取出爬片。準備載玻片一張，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置），將蓋玻片或爬片翻過來，蓋在封片劑上，再用指甲油封片進行成像。
5. 在激光共聚焦成像之前，好用熒光顯微鏡檢查一下細胞狀態和成像效果，再去做激光共聚焦，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。

無需爬片的新方法

    這里要介紹的新方法，大大簡化了樣品準備流程，需要用到專為共聚焦實驗設計的共聚焦培養皿，這里以德國ibidi的共聚焦培養皿為例（81156，德國ibidi）進行說明。共聚焦培養皿的底部是聚合物材質，具有親水表面，讓大多數種類的細胞都可以直接貼壁，無需另外進行包被；同時，它們的底部符合蓋玻片標準——只有180µm的厚度，在折射率，阿貝系數上，它們的性能和標準爬片一致，再加上極低的自發熒光和細胞可以直接貼壁的特性，使它們成為共聚焦成像的培養皿。

  所有的操作都在培養皿中進行，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗，滅菌，包被程序（流程如圖二所示）

圖二：共聚焦培養皿的準備樣品流程，可以直接進行細胞培養－染色－成像操作（圖中為德國ibidi 81156培養皿）

操作流程

1. 在超凈臺中打開共聚焦培養皿的滅菌包裝，拿出培養皿，加入細胞懸液，蓋上皿蓋，放入培養箱中靜置，等待細胞貼壁。常規細胞培養，待細胞長置合適密度再取出，進行免疫熒光染色。
2. 吸出培養基，以PBS清洗細胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞。
3. 20分鐘后，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100
4. 10分鐘后，吸出Triton，清洗細胞后加入BSA封閉。
5. 加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像。

   使用共聚焦培養皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續時間很長，培養皿中的液體非常容易揮發，共聚焦培養皿有皿蓋，可以減少揮發；比如上述提到的ibidi共聚焦培養皿，有個巧妙的鎖扣設計，可以扣緊培養皿，保證在共聚焦成像的過程中，皿中的液體不會揮發(圖三）。

圖三：ibidi共聚焦培養皿的鎖扣設計

方法優勢總結

1.一個培養皿完成細胞培養－染色－成像等系列操作，無需包被，無需爬片，操作簡便；

2.在培養皿里的操作對于操作技術的要求相對更低，也更便捷；

3.培養皿可使用皿蓋減少蒸發，杜絕揮發對成像的影響。